Diabetologia：激活但功能受损的记忆Tregs在1型糖尿病病症进展缓慢的过程中逐渐扩展

从第一次注意到呼吸道自身免疫反应到注意到1标准型白血病临床研究疼痛的方面叛将在婴幼儿时期就有更好的说明了，多个呼吸道自身免疫反应白血病的婴幼儿中的有70%在血清反转后10年内患上白血病，而随访15年的婴幼儿这一比叛将增加到84%。远比，占临床研究1标准型白血病一半以上的标准型1标准型白血病的患病机制还没得到充分的数据分析。

越来越多的人开始用作分期系统来概念1标准型白血病的方面：个锥体在注意到多种呼吸道自身免疫反应时进入第1之前，注意到血糖异常时进入第2之前，注意到疼痛时进入第3之前。一些多发呼吸道自身免疫反应白血病的个锥体，在1期和2期，方面极快，并发展为患病的1标准型白血病。我们之前说明了了一组在首次监测到多种呼吸道自身免疫反应抽取后多于10年无白血病的极比较慢方面者，这组病患人数少，但构造非常明确。随后，我们发现呼吸道自身抗原特异性CD8+T巨噬细胞反应在方面很比较慢的病患中的大锥体上不存在，但在近期患病和长期存在的白血病病患中的很容易监测到。这可能表明，与方面病患远比，这些病患自身免疫反应的调节增强。

早期数据新发现，尽管调节性T巨噬细胞(Treg)数量出现异常，但白血病病患存在一些功能缺陷，其中的最主要对IL-2的反应能力下降。此外，白血病病患中的的不稳定性CD4+T巨噬细胞可能对调节非常具抵抗性，表现为不稳定性T巨噬细胞的作用于减弱，自然产生的Treg和活锥体产生的作用于Treg，以及抗原年中的CD4+T巨噬细胞中的IL-2反应减弱。本数据分析的最终目标是说明了了CD4+调节性T巨噬细胞(Treg)在一小群极很比较慢方面者中的的构造，他们的平均年纪为43岁(31-72岁)，随访时长为18-32年。

方法：BOX数据分析是一项以老年人为基础的横向数据分析，在21岁以下出院的病患亲属中的检查1标准型白血病的可怕诱因。我们之前说明了了长期很比较慢方面者的构造，他们保持良好多重呼吸道自身免疫反应白血病超过10年，但没注意到白血病的临床研究疼痛，比较慢性或非性功能自身免疫。随后，10名在此期间保持良好无白血病并愿意提供大量血液抽取的很比较慢方面者扩展到T和B巨噬细胞功能分析方法。在目前的数据分析中的，8名比较慢方面者(SP组)，中的位年纪43岁(31-72岁)，18 - 32岁之间的呼吸道自身免疫反应白血病。所有的参与者都正处于1标准型白血病方面的1期，尽管一些人随后失去了呼吸道自身免疫反应对某些抗原的尿检，然而，一名病患已经正处于2期多于6年，但没注意到临床研究疼痛，一名病患被病人为白血病，该受测者72岁，在采集实验抽取时，其HbA1c升高到53 mmol/mol(7%)，在数据分析方法中的对该NADP开展了单独评估。分开外周血单个核巨噬细胞(PBMCs)，采用多参数流式巨噬细胞术和T巨噬细胞作用于试验评估NADP中的Treg的频叛将、特异性和功能。用作FlowSOM和CITRUS(聚类鉴定、表征和回归)开展无监理聚类分析方法，评估Treg特异性。

结果：与身心健康NADP远比，来自比较慢方面锥体的心灵CD4+T巨噬细胞的监理聚类看出，转录的心灵CD4+ Treg频叛将增加，与糖皮质激素作用于的TNFR关的蛋白(GITR)隐含增加有关。一名HbA1c升高的病患与方面很比较慢者和匹配的结果表明远比，Treg谱有所不同。功能分析方法表明，与身心健康NADP远比，来自很比较慢方面锥体的Treg内源性的CD4+不稳定性T巨噬细胞作用于明显受损。表现为对不稳定性CD4+T巨噬细胞CD25和CD134隐含的作用于增加。

上图1 深入的特异性分析方法看出，CD4+Treg亚标准型在比较慢方面缓冲区中的增加。由FlowSOM生成的Treg室，汇聚在来自所有NADP的活CD4+CD45RA -巨噬细胞上。根据上面物隐含鉴定出10个元簇:心灵T巨噬细胞_1;心灵T cell_2;心灵T cell_3;心灵T cell_4;CD49b心灵T巨噬细胞;HLA-DR + GITR +心灵T巨噬细胞;磁盘Treg_1;磁盘Treg_2;磁盘Treg_3;和磁盘Treg_4。(a)用作9个不同Treg上面生成的10个元簇的MST。每个数据流代表一个炮兵部队(100个炮兵部队)，非常大的元炮兵部队(10个元炮兵部队)在数据流组远处上色。每个数据流中的的饼上图透露单个上面的隐含级别。(b)每个元聚类的热上图，以看出整锥体上面隐含。(c, d)为HD组(c)和SP组(d)生成上图，以及FlowSOM识别系统的每个元簇的覆盖层。(e-l)远比较稀土元素为每个metacluster箱两条路线上图(稀土元素> 0.05%)确定为HD和SP组:磁盘Treg_2 (e),磁盘Treg_3 (f),磁盘Treg_4 (g), HLA-DR + GITR +心灵T巨噬细胞(h)、心灵T cell_1(i),心灵T cell_2 (j),心灵T cell_3 (k) n d CD49b心灵T巨噬细胞(l)。绿色左上方代表**SP 606。**p< 0.01, Wilcoxon相加小写秩检查。此键适用于上图形部分(a)， (c)， (d)和d (e-l)

上图2 用作CITRUS的预测模标准型断定，Treg频叛将的增加是方面很比较慢的标记。分级门控(a - f)和柑橘分析方法(g-k)比较SP参与者和匹配的HD参与者在CD4+CD45RA−T巨噬细胞上的差别。(a)亲本CD25+ cd127 lotreg和CD25loCD127+T c e l群锥体的标记性上图。CD25+ cd127lotreg被CD39和FOXP3富集，然后通过HLA-DR和GITR隐含开展分开，模拟FlowSOM群锥体。(b) HD(黑点)和SP(白点)组以及NADPSP 606(绿色)中的CD25+ cd127的频叛将概述上图。(c-f) CD25+CD127loCD39+FOXP3+和CD25loCD127+门控孙子集的箱两条路线上图;(c) HLA-DRloGITR−(磁盘Treg_2)， (d) HLA-DRintGITRlo(磁盘Treg_3)， (e) HLA- d RhiGITR+(磁盘Treg_4)， (f) HLA- d RhiGITR+(HLA-DR+GITR+磁盘T cell)。(g - i)果树簇螺旋由(g) CD127， (h) CD25和(i) FOXP3隐含强度着色，对角凸显的簇被识别系统为SP和HD缓冲区之间的不同。(j)箱两条路线上图看出了在SP(白点)和HD(灰点)组中的，CITRUS心灵Treg_3和Treg_4的远比较稀土元素(比叛将)。(k)直方上图看出每个簇的特异性(粉红色)和Treg上面远比较隐含与背景隐含(白色);上列，磁盘Treg_3;下面一行，磁盘Treg_4。背景与所有其他簇中的上面的隐含有关。*p< 0.05， **p< 0.01, Wilcoxon相加小写秩检查

上图3 与身心健康献血者远比，方面很比较慢者心灵treg的GITR增加。每个心灵CD4+T巨噬细胞元簇(心灵T巨噬细胞_1;心灵T cell_2;心灵T cell_3;CD49b +心灵T巨噬细胞;HLA-DR + GITR +心灵T巨噬细胞;磁盘Treg_2;磁盘Treg_3;来自FlowSOM的memory Treg_4)监测每个隐含上面的巨大变化。(a,b)来自HD (a)和S (b)缓冲区的隐含热上图(sp606不最主要在内)。(c,d)心灵Treg_4元簇中的所有HD(白色)、所有SP(白色)和SP 606(绿色)的FlowSOM GITR隐含结合，看出直方上图(c)和概述上图(d)。Wilcoxon相加小写秩和检查，p< 0.07(绿色)所有NADP最主要，p< 0.05(白色)NADPSP 606和匹配的HD不最主要在测试中的。(e,f) HLA-DRhiGITR+Tregs中的GITR隐含，从分级门控，从所有HD(白色)、所有SP(白色)和SP 606(绿色)结合，看出直方上图(e)和概述上图(f) *p< 0.05, Wilcoxon相加小写秩检查

上图4 来自很比较慢方面的CD4+ treg巨噬细胞遏制不稳定性CD4+T巨噬细胞的能力下降。SP组用白色的两条路线和左上方透露，HD组用黑色的两条路线和左上方透露，绿色的两条路线/左上方透露NADPsp606。用作CD4+CD25+ Treg分选试剂盒对CD4+T巨噬细胞开展分选。CD4+CD25−(反之亦然者)被上面为CFSE, Treg按观察的比叛将反应物。用抗CD3 /28微珠转化巨噬细胞，人才培养3同一天开展流式巨噬细胞术监测。(a-d)与CD4+反之亦然者远比较应的treg人才培养(自锥体)(e-h) HD、SP或SP 606 Treg与HD反之亦然者人才培养。(a,b,f) CFSE增殖(a,e)和CFSE作用于一般而言(b,f)。(c, d,h) CD25 (c,g)和CD134 (d,h)的作用于一般而言。用作白血病对照(转录的响应巨噬细胞不含treg)计算作用于一般而言。*p< 0.05， **p< 0.01， ***p< 0.001，重复测量双向方差分析方法。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重比较测试

上图5 不稳定性CD4+T巨噬细胞对很比较慢方面的T巨噬细胞转化的作用于非常敏感。SP组用白色的两条路线和左上方透露，HD组用黑色的两条路线和左上方透露，绿色的两条路线/左上方透露NADPsp606。用作CD4+CD25+Treg分选试剂盒对CD4+T巨噬细胞开展分选。CD4+CD25−(反之亦然者)被cfsel上面，treg按观察的比叛将反应物。用抗CD3 /28微珠转化巨噬细胞，人才培养3同一天开展流式巨噬细胞术(CD25反染)和巨噬细胞因孙子分析方法。HD Treg与HD、SP或sp606反之亦然者共同人才培养。(a,b) CFSE增殖(a)和CFSE作用于%-(b)。(c,d) CD25作用于%-(c)和CD134作用于%-(d)。(e,f) IFN-γ(e)和IL-17A (f)在共人才培养中的的隐含。***p< 0.001， **p< 0.01，重复测量双向方差分析方法。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重比较测试

结论：我们证明了的结论是，来自很比较慢方面孙子的转化心灵CD4+Treg在GITR隐含中的得到了扩展和丰富，忽略了进一步数据分析Treg在1标准型白血病后果个锥体中的的异质性的必要性。

原文出处：

Boldison J, Long AE, Aitken RJ,et al.Activated but functionally impaired memory Tregs are expanded in slow progressors to type 1 diabetes.Diabetologia 2021 Oct 28